iRNR kepuriavimas: biologinės funkcijos ir pritaikymai

iRNR kepuriavimas eukariotuose
RNR trifosfatazė (TPazė) pašalina γ-fosfatą iš 5‘ trifosfato ir pereina 5‘ gale į difosfatą ir neorganinį fosfatą.

RNR trifosfatazė atsakinga už terminalinių poliribonukleotidų trifosfatų pavirtimą į difosfatus, taip pat atsakinga už ribonukleozido trifosfato hidrolizę iki difosfato in vitro. Gyvūnuose RNR trifosfatazė yra nepriklausoma nuo dvivalenčių metalų jonų ir yra pastoviai susijusi su GTazės aktyvumu. RNR TPazė susijusi su cisteino fosfatazės šeimos baltymais. Cisteinas lokalizuojasi įtrūkimuose ir sudaro kovalentinius cistenilfosfoenzimus, kurie tarpininkauja su γ-fosfatu skylant β-γ fosfoanhidridiniam ryšiui. Teigiama, kad aktyvių saitų gilūs įtrūkimai leidžia fermentui atskirti terminalinį 5‘ trifosfatą nuo 5‘ difosfato.

Guanililtransferazė (GTazė) panaudoja GTP molekulę ir suformuoja kovalentinį tarpininką kartu su lizil-Nζ-5‘fosfoguanozinu. Dalyvaujant 5‘ RNR difosfatui, GTazė perkelia 5‘-fosfoguanoziną (GMP) į 5‘ difosfatą, dėl ko susidaro 5‘-5‘ trifosfato jungtis tarp pirmos RNR bazės ir kepurėlę formuojančios bazės.

RNR guanililtransferazė, dar kitaip vadinama GTP-RNR guanililtransferazė, atsakinga už GMP dalies virtimą iš GTP į 5‘ difosfatą, formuojant kepurėlę 5‘ gale. RNR GTazės priklauso nukleotidil transferazių subšeimai, į kurią taip pat įeina nuo ATP- ar NAD+- priklausomos DNR ligazės. Ši nukleotidil transferazių klasė yra tiek struktūriškai, tiek mechaniškai išlikusi visuose gyvybės domenuose. Jie katalizuoja nukleino rūgščių ligazę dviem žingsniais: lizil-Nζ kovalentinio tarpinio junginio ir 5‘-5‘ fosfo(deoksi)ribozės produkto susidarymas.

Panašiai su DNR ir RNR ligazėmis, RNR GTazės yra sudarytos iš dviejų domenų – N-terminalinės GTazės su KxDG pagrindu ir C-terminalinio oligonukleotido/oligosacharido (OB) surišimo domeno. OB baltymai egzistuoja visose gyvybės karalystėse atlieka įvairias funkcijas: DNR replikacija, taisymas, rekombinacija, transkripcija, šalčio stresinis atsakas ir telomerų priežiūra.

Atviros ir uždaros konformacijos Chlorelos viruso PBCV-1 kepurėlės formavimo fermentas (PDB 1CKM). Šis fermentas turi dviskiltę kristalinę struktūrą, tai N-terminalinis guanililtransferazės domenas ir C-terminalinis OB klostinis domenas. Šie vienetai yra asimetriniai. Aktyvus saitas yra sąveikoje tarp dviejų domenų.

m7G kepurėlės specifinė 2‘O MTazė modifikuoja 2‘O +1 ribozę ir sukuria kepurėlės 1 struktūrą.

Guanino-N7 MTazė katalizuoja S-adenosil metionino (SAM) metilo grupės perkėlimą į GpppRNR, kad susidarytų m7GpppRNR ir S-adenosil homocisteinas (SAH). RNR guanino-N7 MTazės yra klasifikuojamos kaip Rossmanno‘o klostinė metiltransferazė (Rossmann fold methyltransferase, RFM), nes su SAM susirišęs domenas yra struktūriškai panašus į Rossmann‘o klostę. Tikėtina, jog metilo grupės perkėlimas pakeičia klasikinį SN2 mechanizmą dėl egzociklinių amino DNR metiltransferazių veiklos.

Kepurėlės kokybės kontrolės sistema
Pre-iRNR splaisingas ir poliadenilinimas (poly(A) uodegėlės prijungimas prie iRNR, svarbus brandinant iRNR transliacijai) susijęs su kepurėlės kokybės kontrolės mechanizmu. Žinduolių ląstelėse, baltymas DXO/Dom3Z atlieka tris funkcijas: valdo kepurėlės išardymo, pirofosfohidrolazės ir 5‘ 3‘ egzonukleazės aktyvumą. Fermentas specifiniu būdu išformuoja kepurėlę be metilo grupės (GpppN) ir degraduoja iki 5‘ monofosfato panaudojant 5‘ 3‘ egzonukleazę. DXO/Dom3Z inhibavimas pasižymi padidėjusiu pre-iRNR lygiu. Panašu, jog fermentas pašalina nemetilintas pre-iRNR. Taip pat fermento nuslopinimas pasižymi pirmų ir vėlesnių intronų sutrikusiu splaisingu (nekoduojančių nukleotidų sekų iškirpimas) bei sutrikusiu 3‘ poliadenilinimo skilimu in vivo. Šie procesai rodo sąsają tarp kepurėlės N7-metilinimo ir pre-iRNR splaisingo bei poliadenilinimo.

m7G kepurėlės biologinis vaidmuo:
• Kokybiškas pre-iRNR splaisingas;
• Splaisosomų kaupimas;
• 3‘ galo apdorojimas;
• RNR eksportas;
• MikroRNR biogenezė;
• Poliadenilinimo endonukleolitinio skilimo sumažinimas;
• Baltymų kaupimas.

Transliacijos iniciacija ir iRNR pseudocirkuliacija citoplazmoje
iRNR transliacija inicijuojama nuo kepurėlės priklausomo mechanizmo. Prieš patenkant į citoplazmą, CBC lieka prikibęs prie iRNR kepurėlės, telkia eIF4G ir RNR helikazę eIF4A 5‘ iRNR gale. Kiti iniciacijos faktoriai, CBP80/20-eIF4III, Met-tRNRi ir du ribosominiai subvienetai inicijuoja transliaciją. Po pirmo transliacijos ciklo, vyksta mRNP iniciacijos komplekso perkonstravimas. Importinas (IMP)-β prisiriša prie IMP-α, stabilaus CBC prikibimo dalyvio. Vyksta sąveika su eIF4F kompleksu, todėl prasideda stabilūs transliacijos ciklai. Prisirišus prie iRNR kepurėlės, eIF4F komplekso eIF4G sąveikauja su poly(A) prisirišimo baltymu PABP1, prikibusiu prie iRNR poly(A) uodegėlės. Čia susidaro transliuojančios iRNR pseudožiedinė struktūra. Postuluojama, jog iRNR pseudožiedinė struktūra užtikrina pilnai nurašytą iRNR ir padidina ribosomų funkcionalumą.

RNR kepuriavimo mechanizmo skirtumai

Virusinės RNR “kepurėlės” formavimo mechanizmai
Kiek virusai skiriasi tarpusavyje, tiek skiriasi ir jų “kepurėlės” sudarymo mechanizmai.

• Alfavirusai ((+)ssRNR), pavyzdžiui, čikungunijos virusas, turi pertvarkytą sistemą skirtą RNR “kepurėlės” sudarymui. Guanozin-5’-trifosfatas (GTP) pirmiausiai modifikuojamas ir kovalentiškai sujungiamas su GTaze ir vėliau, kaip m7GMP, pernešamas ant ppRNR m7G “kepurėlės” formavimui. Šis procesas susijęs su RdRp (baltymu, kuris katalizuoja transkripciją) veikla, per baltymas-baltymas sąveiką.
  
• Rabdovirusai ((-)ssRNR) pasižymi unikaliu RNR “kepurėlės” formavimo mechanizmu. Vietoje baltymo-GMP komplekso sudarymo GTazės pagalba yra koduojama RNR:GDP poliribonukleotidiltransferazė (PRN-Tazė), kuri formuoja kovalentinę jungtį 5’ gale per monofosfatinę grupę. Fermento pagalba 5’ monofosfatinė RNR grupė keičiama į GDP, formuojama GpppRNR struktūra, kuri vėliau modifikuojama į m7G “kepurėlė” 1 ir 2’O metilinta “kepurėlė” 1. Įdomiausia, kad 2’O Mtazė dalinasi ta pačia SAM jungimosi vieta su guaninu-N7 Mtaze ir nereikalingas N7 metilinimas 2’O metilinimui. Metilinimas ir PRNTazės aktyvumas yra koduojamas per L-baltymą, kuris taip pat yra virusinės RdRp veikla.
  
• Flavivirusai koduoja vieną Mtazę, kuri katalizuoja guanozino N7 amino metilinimą. Įrodyta, kad Vakarų Nilo viruso kepurėlės MTazė keičia Gpppa-RNR į m7GpppA-RNR, kuri vėliau skaidosi ir vėl asocijuojasi su kita MTazės molekule.
  

Daugiafunkciniai “kepurėlės” formavimo fermentai

• Raupų virusą koduoja heterodimerinis RNR “kepurėlės” formavimo fermentas, susidedantis iš didelio D1 subvieneto ir mažesnio D12 subviento. Nors pilnai užtektų ir D1 subvieneto pilnam “kepurėlės” 0 suformavimui, tačiau guanino-N7 MTazės veikla reikalauja asociacijos su D12 subvienetu efektyviam funkcionavimui. Struktūriniai ir biocheminiai duomenys rodo, kad guanino-N7 MTazės ir D12 sąveika skatina konformacinius pakitimus, reikalingus efektyviai katalizei. Raupų viruso “kepurėlės” fermentų struktūra rodo, kad trijų fermentų veikla tvarkingai išdėstyta tarp atskirų modulių iš TPazės, GTazės ir guanino-N7 MTazės tarp N- ir C- galų.
• Mėlynojo liežuvio ligos viruso kapingo fermentas VP4 sudarytas iš visų 4 fermentinių veiklų reikalingų “kepurėlės” 1 struktūrai sudaryti. Baltymai įgyja pailgą formą su N-galo ir C-galo sritimi ir yra atsakingi už homodimerizaciją, kuri reikalauja fermento VP4 agregato susidarymo. Guanino-N7 MTazė ir 2’O MTazė gerai saugoma su kitomis žinomomis struktūromis, bet RNR TPazės ir GTazės sritys negali būti vienareikšmiškai identifikuotos. Biocheminiais tyrimais nustatyta lizino lokalizacijos vieta, atsakingo už lizilo-fosfoguanozino tarpusavio sąveiką netoli C-galo baltymuose.

“Kepurėlės” išplėšimas
Kai kurie RNR virusai vietoj “kepurėlės” formavimo mechanizmo naudoja savitą mechanizmą vadinamą “kepurėlės” išplėšimu/vagyste. Influenza virusas ((-)ssRNR) RNR-priklausoma RNR polimerazė (RdRp) yra kompleksas susidedantis iš 3 baltymų: polimerazės bazinis baltymas 1 (PB1), polimerazės bazinis baltymas 2 (PB2) ir polimerazės rūgštinis baltymas (PA). Po branduolio susidarymo PB2 subvienetas jungiasi prie šeimininkės RNR “kepurėlės” struktūros. PA endonukleazė atkerpa pirmuosius 10-15 nukleotidų nuo šeimininkės RNR “kepurėlės”, kurie vėliau naudojami kaip praimeriai virusinės iRNR transkripcijai. Pirmą kartą buvo pademonstruotas naudojant žmogaus globino iRNR.

Pavyzdžiui S. Cerevisiae totivirusas L-A ir L-BC (dsRNR) naudoja daug tikslesnį “kepurėlės” išplėšimo mechanizmą. Virusinis Gag baltymas atskiria m7GMP grupę nuo šeimininkės RNR ir suformuojama histodilo-m7GMP kovalentinį ryšį. Tada m7GMP grupė perkeliama į virusinės RNR 5’ difosfato galą. “Kepurėlės” išplėšimo proceso panašumas į kanoninės GTazės veiklą rodo evoliucinį ryšį tarp totivirusų ir eukariotų “kepurėlės” formavimo mechanizmų.

Taikymas

• Egzogeninės iRNR technologijos.

Sukaupus daugiau žinių apie ribozių modifikacijas, ląstelių degradacijos kelius ir sujungus su naujomis pažengusiomis technologijomis tapo nesunku valdyti baltymų ekspresiją in situ. Kamieninių ląstelių perprogravimas, skiepijimas ir terapijoje naudojamų baltymų ekspresija yra tik keli iš vis daugėjančių egzogeninių iRNR technologijų pavyzdžių. Pirmiausia, nepasitaiko nenumatytų RNR integracijų į genomą, kas gali nutikti su DNR pagrindą turinčiais vektoriais. Antra, DNR vektorius reikia įvesti į branduolį, kad būtų galima transkribuoti iRNR, kuris tada eksportuojamas į citoplazmą tolesnei transliacijai, o iRNR pernešamas tiesiogiai, aplenkiant šiuos sunkumus. Be to, buvo įrodyta, kad šis procesas geresnis kalbant apie vakcinaciją, nes siekiama greitesnio skilimo ir trumpalaikio veikimo. Trečia, iRNR naudojamas in situ leidžia atlikti kelių baltymų ekspresiją vienu metu. Taikant iRNR terapijoje galima greičiau pagaminti įvairias vakcinas, jas panaudoti, kas yra labai svarbu per įvairių ligų proveržius.

• Funkcinės iRNR fermentų sintezė.

Kad perkėlimo metu būtų išvengta gyvūnų ar virusų nepageidaujamos genetinės medžiagos patekimo į ląsteles, pageidaujama gaminti terapines RNR in vitro. Šiam procesui dažniausiai naudojami raupų kapingo fermentai, nes leidžiama visiškai atskirti RNR. Tokiu būdu įgimto imuniteto atsakas sumažinimas iki minimumo, o “kepurėlė” 0 gali būti toliau modifikuojama.

• iRNR vakcinos.

Vakcinacija naudojant iRNR turi daug naudingų sąvybių lyginant su tradicinėmis gyvų susilpnintų sukėlėjų vakcinomis. Tokios vakcinos yra trumpalaikės ir dažnai save ribojančios. Tokias vakcinas galima sureguliuoti pagal poreikį per RNR funkcijas ir genų ekspresiją. Gamyba paprasta, atsakas greitas, o efektyvumas didesnis lyginant su DNR vakcinomis. iRNR gali būti transportuojama tiek virusinių vektorių, tiek sintetinio transportinio nešėjo. Naujausi pasiekimai kuriant sintetinius nešėjus leidžia efektyviai panaudoti iRNR vakcinacijoje, todėl vis mažiau naudojami virusiniai vektoriai ir mažinama tikimybė užteršti nešėjus gyūninėmis medžiagomis. iRNR gali būti susintetinta fermentais in vitro arba pagaminta in situ naudojant savarankiškai amplifikuojančią iRNR.

• Savarankiškai amplifikuojanti iRNR.

Pasinaudojant RNR transkripcijos – “kepurėlės” formavimo alfavirusuose mechanizmais, savarankiškai amplifikuojanti iRNR technologija buvo sukurta kaip priemonė vakcinacijai in situ. Alfavirusai turi (+)ssRNR genomą, koduojamą nestruktūrinės prieš-baltyminės nsp1-4, skirtą RdRr, transkripcijos ir “kepurėlės” formavimo, du kapsidės baltymus E2 ir E1. Tyrimai atskleidė, kad pakeičiant kapsidės baltymų genus tais, kurie mus domina, yra sulaukiama stipresnio imuninio atsako, nei vakcinacijos standartiniu iRNR, tačiau tyrimai kol kas atlikti tik su gyvūnais.

Iš anglų k. vertė: Mindaugas Mažuolis ir Vygantas Martinaitis
Šaltinis: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27317694